Pantoprazol contra komórki macierzyste raka żołądka – nowa nadzieja?

Czy pantoprazol może stać się bronią przeciwko komórkom macierzystym raka żołądka?

Rak żołądka zajmuje piąte miejsce wśród najczęściej diagnozowanych nowotworów na świecie, powodując około 660 000 zgonów rocznie. Szczególnie wysoką zachorowalność odnotowuje się w krajach azjatyckich – Mongolii, Japonii, Chinach i Korei Południowej. Pomimo spadku globalnej śmiertelności, w Iranie obserwuje się wzrost liczby przypadków. Kluczowym wyzwaniem w terapii pozostaje eliminacja komórek macierzystych raka żołądka (GCSC), które odpowiadają za nawroty, przerzuty i oporność na leczenie.

Komórki macierzyste nowotworów to morfologicznie odrębna grupa komórek o zdolności do samoodnawiania i generowania heterogennej populacji komórek nowotworowych. Po raz pierwszy zidentyfikowane w białaczce szpikowej, następnie wykryto je w guzach litych – mózgu, jelita grubego, trzustki, piersi i żołądka. Prawie wszystkie nowotwory nawracają po standardowej terapii właśnie z powodu przetrwania komórek macierzystych, które nie są eliminowane przez klasyczne metody leczenia.

Szlak sygnalizacyjny Wnt odgrywa kluczową rolę w rozwoju zarodkowym, proliferacji komórkowej, apoptozie i homeostazy tkankowej. Białka Wnt (19 ligandów) wiążą się z receptorami błonowymi (10 członków rodziny Frizzled) i aktywują sygnalizację kanoniczną oraz niekanoniczną. Dowody wskazują, że szlak Wnt uczestniczy we wzroście guza, przerzutach i powstawaniu wielu nowotworów. Jego zahamowanie może stanowić istotny cel terapeutyczny – wcześniejsze badania wykazały, że pantoprazol hamuje proliferację i przerzuty w liniach komórkowych raka żołądka poprzez blokowanie tego szlaku.

Repozycjonowanie leków – wykorzystanie zatwierdzonych preparatów do nowych wskazań – to strategia o niskim ryzyku i krótszym czasie wprowadzenia na rynek. Koszt opracowania nowego leku tradycyjną metodą wynosi około 12 miliardów dolarów, podczas gdy repozycjonowanie to wydatek rzędu 1,6 miliarda. Pantoprazol, inhibitor pompy protonowej (PPI), jest zatwierdzonym lekiem nieodwracalnie hamującym pompy H+/K+ ATP, stosowanym w leczeniu zapalenia przełyku, zespołu Zollingera-Ellisona oraz w eradykacji Helicobacter pylori. W niniejszym badaniu zbadano wpływ pantoprazolu na szlak Wnt, przerzuty, angiogenezę oraz ekspresję genów macierzystości w GCSC izolowanych z linii MKN-45.

Jak izolowano komórki macierzyste i testowano pantoprazol?

Komórki linii MKN-45 hodowano w podłożu DMEM/F12 z 10% FBS w warunkach standardowych (37°C, 5% CO₂). Do izolacji GCSC pokryto powierzchnię naczyń cienką warstwą agarozy, a następnie umieszczono pojedyncze komórki MKN-45 (3×10⁴) w zawiesinie. Po 14-16 dniach większość komórek nowotworowych uległa apoptozie, pozostawiając jedynie kolonie GCSC o zdolności do samoodnawiania.

Wpływ pantoprazolu (czystość 98%) na żywotność GCSC oceniano testem błękitu trypanu. Komórki traktowano pantoprazolem w stężeniach 0-100 µmol przez 24 godziny, po czym liczono żywe (białe) i martwe (niebieskie) komórki w hemocytometrze. Aktywność metaloproteinaz MMP-2 i MMP-9 analizowano metodą zymografii – supernatanty hodowli elektroforezowano na żelu poliakrylamidowym z żelatyną, a następnie wizualizowano strefy degradacji żelatyny po wybarwieniu błękitem Coomassie.

Ekspresję genów (Oct3/4, SOX2, NANOG, KLF4, WNT1, CTNNB1, CTNNBIP1, KREMEN1, SMARCD1, SUFU) mierzono metodą real-time RT-PCR z wykorzystaniem GAPDH jako genu referencyjnego. Poziomy białkowe KREMEN1, SMARCD1 i CTNNBIP1 potwierdzono metodą Western blot z β-aktyną jako kontrolą wewnętrzną. Angiogenezę oceniano in vitro, hodując ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) na Matrigelu z 50 µmol pantoprazolu przez 24 godziny i licząc punkty rozgałęzień naczyń.

Czy pantoprazol skutecznie redukuje żywotność komórek macierzystych raka?

Test błękitu trypanu wykazał zależne od dawki zmniejszenie żywotności GCSC po zastosowaniu pantoprazolu. W zakresie stężeń 0-100 µmol obserwowano stopniowy spadek liczby żywych komórek (p<0,05 vs kontrola). Najsilniejszy efekt uzyskano przy stężeniu 100 µmol, jednak do dalszych eksperymentów wybrano 50 µmol jako optymalną dawkę roboczą, która wykazywała istotne biologicznie działanie przy zachowaniu części żywych komórek do analiz molekularnych.

Zymografia ujawniła, że pantoprazol (50 µmol, 24 h) znacząco obniżył aktywność MMP-2 i MMP-9 w GCSC w porównaniu z komórkami nietraktowanymi. Te dwie metaloproteinazy macierzy odgrywają kluczową rolę w degradacji błony podstawnej i macierzy pozakomórkowej, umożliwiając inwazję i przerzuty komórek nowotworowych. Ich hamowanie sugeruje potencjał przeciwprzerzutowy pantoprazolu.

Jak pantoprazol wpływa na ekspresję genów macierzystości?

Analiza real-time RT-PCR wykazała istotne zmiany w profilu ekspresji markerów macierzystości po traktowaniu GCSC pantoprazolem (50 µmol, 24 h). Poziom RNA trzech kluczowych markerów uległ drastycznemu obniżeniu: CD44 do 0,33×, Oct3/4 do 0,28× oraz NANOG do 0,24× wartości kontrolnych. Te czynniki transkrypcyjne są niezbędne dla utrzymania zdolności do samoodnawiania i cech macierzystych GCSC, więc ich supresja wskazuje na osłabienie fenotypu komórek macierzystych.

Zaskakująco, ekspresja dwóch innych markerów wzrosła: SOX2 do 4,67× oraz KLF4 do 3,3× poziomu kontrolnego. Ten paradoksalny wzrost może odzwierciedlać kompensacyjną odpowiedź komórkową lub – co sugerują niektóre badania – rolę SOX2 jako supresora wzrostu guzów żołądka. Carrasco wykazał, że białko SOX2 pełni istotną funkcję w hamowaniu wzrostu nowotworów żołądka, a jego spadek może wręcz promować rozwój raka.

„Nasze wyniki sugerują, że pantoprazol może modulować fenotyp komórek macierzystych poprzez złożone zmiany w sieci regulacyjnej genów macierzystości” – wynika z analizy danych ekspresji genowej.

W jaki sposób pantoprazol hamuje szlak sygnalizacyjny Wnt?

Kluczowe odkrycie badania dotyczy wpływu pantoprazolu na szlak Wnt1. Ekspresja RNA WNT1 (ligand aktywujący szlak) spadła do 0,36×, a CTNNB1 (β-katenina, główny element efektorowy szlaku kanonicznego) do zaledwie 0,15× wartości kontrolnych. Ta głęboka supresja wskazuje na bezpośrednie hamowanie aktywacji szlaku Wnt przez pantoprazol.

Równocześnie zaobserwowano wzrost ekspresji czterech negatywnych regulatorów szlaku Wnt: SMARCD1 wzrósł 4,1×, CTNNBIP1 2,3×, SUFU 1,7× oraz KREMEN1 3,7×. CTNNBIP1 wiąże β-kateninę i hamuje sygnalizację Wnt1, podczas gdy SMARCD1, KREMEN1 i SUFU działają jako geny supresorowe nowotworów – ich nadekspresja redukuje proliferację komórkową i powstawanie nowotworów.

Western blot potwierdził zmiany na poziomie białkowym: ilość białek KREMEN1, SMARCD1 i CTNNBIP1 wzrosła w GCSC traktowanych pantoprazolem w porównaniu z kontrolą. Ta zgodność między poziomami RNA i białka wzmacnia wiarygodność obserwowanych efektów molekularnych i wskazuje na funkcjonalną modulację szlaku Wnt przez pantoprazol.

Czy pantoprazol wpływa na zdolność tworzenia naczyń przez nowotwór?

Test tworzenia struktur naczyniowych in vitro wykazał, że pantoprazol istotnie hamuje angiogenezę. Komórki HUVEC hodowane na Matrigelu bez leku różnicowały się w charakterystyczne struktury kapilarowe z licznymi punktami rozgałęzień. Natomiast HUVEC traktowane 50 µmol pantoprazolu przez 24 godziny wykazywały znacząco zmniejszoną zdolność do formowania naczyń – liczba punktów rozgałęzień była istotnie niższa.

Ten efekt przeciwangiogenny jest szczególnie istotny klinicznie, ponieważ nowotwory wymagają rozwoju nowych naczyń krwionośnych do wzrostu powyżej 1-2 mm oraz do rozsiewu przerzutowego. Hamowanie angiogenezy może więc ograniczać zarówno wzrost guza pierwotnego, jak i jego zdolność do tworzenia ognisk wtórnych. Wynik ten jest zgodny z wcześniejszymi obserwacjami Hahma, który wykazał, że pantoprazol redukuje angiogenezę in vitro, chociaż Lee opisał przeciwne efekty – co podkreśla potrzebę dalszych badań.

Jakie znaczenie mają te odkrycia dla terapii raka żołądka?

Wyniki badania otwierają nową perspektywę w leczeniu raka żołądka poprzez repozycjonowanie pantoprazolu – leku o potwierdzonej bezpieczeństwie i szeroko stosowanego w gastroenterologii. Tradycyjne metody leczenia (chirurgia, chemioterapia) nie eliminują skutecznie GCSC, co prowadzi do nawrotów u znacznej części pacjentów. Pantoprazol, hamując szlak Wnt i redukując fenotyp macierzysty komórek nowotworowych, może wypełnić tę lukę terapeutyczną.

Szczególnie interesujące jest potencjalne zastosowanie pantoprazolu w terapii skojarzonej. Wcześniejsze badania wykazały, że pantoprazol zwiększa pH endosomów komórek nowotworowych, co poprawia dystrybucję doksorubicyny w guzach litych i wzmacnia jej efekt terapeutyczny. Kombinacja pantoprazolu z klasycznymi cytostatykami mogłaby więc jednocześnie eliminować komórki różnicujące się i komórki macierzyste odpowiedzialne za nawroty.

Należy jednak podkreślić istotne ograniczenia obecnego badania. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono in vitro na pojedynczej linii komórkowej MKN-45, co nie odzwierciedla złożoności mikrośrodowiska guza in vivo. Brakuje danych na temat długoterminowego bezpieczeństwa wysokich dawek pantoprazolu oraz jego skuteczności w modelach zwierzęcych i badaniach klinicznych. Istnieją też sprzeczne doniesienia dotyczące wpływu długotrwałego stosowania inhibitorów pompy protonowej na ryzyko raka żołądka – podczas gdy Cheung sugerował wzrost ryzyka po trzech latach terapii, Brunner i Schneider nie potwierdzili tego w badaniach obserwacyjnych.

Przed wdrożeniem pantoprazolu do praktyki onkologicznej konieczne są badania in vivo na modelach zwierzęcych oraz kontrolowane badania kliniczne oceniające skuteczność, optymalną dawkę i potencjalne działania niepożądane długoterminowej terapii. Należy również zbadać, czy efekty obserwowane w linii MKN-45 są powtarzalne w innych liniach komórkowych raka żołądka oraz czy występują u pacjentów z różnymi podtypami histologicznymi tego nowotworu.

Co nowego wnosi to badanie do wiedzy o terapii raka żołądka?

Badanie dostarcza pierwszych dowodów molekularnych na działanie przeciwnowotworowe pantoprazolu wobec komórek macierzystych raka żołądka. Lek ten hamuje szlak Wnt1 poprzez jednoczesną supresję aktywatorów (WNT1, CTNNB1) i indukcję inhibitorów (KREMEN1, SMARCD1, CTNNBIP1, SUFU), co prowadzi do redukcji fenotypu macierzystego GCSC. Dodatkowo pantoprazol zmniejsza aktywność metaloproteinaz MMP-2/MMP-9 oraz hamuje angiogenezę, co sugeruje wielokierunkowe działanie przeciwnowotworowe.

Repozycjonowanie pantoprazolu jako potencjalnego leku wspomagającego w terapii raka żołądka jest atrakcyjne ze względu na znany profil bezpieczeństwa i niski koszt. Jednak przed klinicznym zastosowaniem niezbędne są badania in vivo i kontrolowane próby kliniczne oceniające długoterminową skuteczność i bezpieczeństwo tej strategii terapeutycznej. Szczególnie istotne będzie określenie, czy efekty obserwowane in vitro przekładają się na korzyści kliniczne u pacjentów z rakiem żołądka oraz czy pantoprazol może zwiększać skuteczność standardowej chemioterapii.